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激光共焦扫描显微镜使用情况分析简述
点击次数:332 发布时间:2018-03-07
   激光共焦扫描显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测,来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上,该点所发射的荧光成像在探测针孔上,该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。
  照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的,因此被探测点即共焦点,被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上,为了产生一幅完整的图像,由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描,从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z 轴上下移动,将样品新的一个层面移动到共焦平面上,样品的新层面又成像在显示器上,随着Z 轴的不断移动,就可得到样品不同层面连续的光切图像。
  如何利用激光共焦扫描显微镜实时监测细胞内钙离子变化?
  (1)将细胞种在共焦小皿中,
  (2)将用 FLuo3等银光染料标记好样本,在显微镜下找到合适的细胞。
  (3)确定采集图像的条件,包括针孔的大小、光电倍增管的增益、滤片系统的选择、扫描 速度和扫描密度等, 扫描速度和扫描密度要精心选择, 它直接影响采样频率, 即会影响测量 结果。
  (4)根据细胞种类和所加的药物等实验要求,确定采集频率,即采集每一幅图像的间隔时 间。 当需要采样频率较高时, 采集每一幅图像的时间间隔可设定为零, 此时采样频率的快慢 取决于扫描速度和扫描密度。 如果仍然不能满足 Ca2+快速变化的要求, 应加快扫描速度和 减少扫描密度,或采用线扫描。然后根据扫描的总时程,确定共需采集多少幅图像。
  (5)开始采集图像,加药前采集 1分钟作为静息水平对照,加药后继续扫描。程序设定加 药的等待时间。
  (6)采集图像之后或采集之前,勾画感兴趣的细胞或细胞内某个区域(核周、胞浆、胞核 或突起等) ,计算机会描绘出时间-荧光强度曲线。
  激光共焦扫描显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点 探测, 来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上, 该点所发射的 荧光成像在探测针孔内, 该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。 照明针孔与探测针孔对 被照射点或被探测点来说是共轭的, 因此被探测点即为共焦点, 被探测点所在的平面即为共 焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上,为了产生一幅完整的图像, 由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描, 从而产生一幅完整的共焦图像。 只要载物台沿着 Z 轴上下移动,将样品新的一个层面移动到共焦平面上,样品的新层面又成像在显示器上, 随着 Z 轴的不断移动,就可得到样品不同层面连续的光切图像。
  激光共焦扫描显微镜的设计特点:
  1. 点照明。
  2. 具有照明pinhole 和探测pinhole。
  3. 照明pinhole 和探测pinhole 共轭(共焦), 共焦点即被探测点,被探测点所在的平面为共焦平面。
  4. 具有扫描系统――逐点扫描成像。
  5. 具有多个(四个)荧光通道,可同时探测多个被标记物。
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